Лекция № 3.

Количество часов: 2

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК

1. Световая микроскопия

2. Электронная микроскопия, п реимущества и недостатки. Разновидности электронной микроскопии

Клетки очень малы по размерам и в тоже время сложно устроены. Поэтому для успешного изучения строения и функционирования клетки необходимо знать и владеть соответствующими экспериментальными методами.

На первом этапе развития цитологии единственным способом изучения клетки было световое микроскопирование .

Микроскоп – это прибор, позволяющий получить увеличенное изображение мелких объектов, не видимых невооруженным глазом. В микроскопии принято использовать следующие единицы длины:

микрометр (1 мкм – 10 -6 м );

нанометр (1 нм – 10 -9 м );

ангстрем (1Å – 10 -10 м ).

Существуют световое и электронное микроскопирование. В световом микроскопе для получения увеличенного изображения используется свет, в электронном - поток электронов. Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Разрешающая способность – это наименьшее расстояние, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки. Разрешающая способность человеческого глаза составляет около 100 мкм. Это означает, что невооруженным глазом с расстояния 25 см наблюдатель со средней остротой зрения может отличить одну точку от другой, если они отстоят друг от друга на расстоянии не менее 100 мкм. Если рассматриваемые точки находятся на расстоянии менее 100 мкм, то они кажутся одной расплывчатой точкой. Лучший современный световой микроскоп дает возможность рассмотреть структуры с расстоянием между элементами около 0,25 мкм, электронный микроскоп - порядка 1,5 А.

Световое микроскопирование - это совокупность методов наблюдения микрообъектов с помощью различных оптических микроскопов. Эти методы существенно зависят от типа объектива микроскопа, вспомогательных приспособлений к нему, вида микрообъекта и способа подготовки его для наблюдения, а также от характера его освещения при наблюдении. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена размерами, сравнимыми с длиной световой волны (0,4–0,7 мкм для видимого света). Однако многие элементы клеточной структуры значительно меньше по размерам. Кроме того, при использовании обычного светового микроскопа большинство структур живой клетки являются оптически пустыми. Оптически пустыми называют структуры, которые прозрачны и почти не отличаются по показателю преломления от окружающей их среды. Для выявления таких структур были разработаны различные способы фиксации и окраски материала.

Фиксация – это обработка, которая быстро прерывает процессы жизнедеятельности клетки и по мере возможности сохраняет неизменными структуру клеток и тканей. После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, фиксируется местоположение и стабилизируется структура макромолекул.

Окрашивание применяется для оптической дифференциации клеточных структур, а также в цитохимических исследованиях для выявления мест локализации химических соединений. Например, основные красители (гематоксилин) обладают сродством к содержимому ядра, а кислотные красители (эозин) окрашивают цитоплазму. Для изучения живых клеток используются витальные (прижизненные) красители . Витальные красители сравнительно легко проникают в живые клетки и окрашивают некоторые структуры, не повреждая их. Все же витальные красители не совсем безвредны для клетки, и после длительного воздействия приводят ее к гибели. К витальным красителям относятся нейтральный красный (для окрашивания цитоплазмы), метиленовый синий (окраска комплекса Гольджи) и др. При помощи витальных красителей удалось доказать существование некоторых органоидов клетки, которых раньше принимали за артефакты.

Артефакт – изменение, которое возникает в ходе приготовления препарата.

Перед проведением исследований клетки или кусочки ткани обычно заливают в расплавленный парафин или специальную смолу. Использованная для заливки среда охлаждается или полимеризуется. В результате этого образуется твердый блок, который режут на очень тонкие срезы с помощью микротома. Обычно толщина срезов для световой микроскопии составляет 1-10 мкм. Недостатком этого метода является повреждение ряда структур клетки. Поэтому применяют метод приготовления срезов с помощью быстрого замораживания. Замороженную ткань режут на специальном микротоме (криотоме), оборудованном холодной камерой (криостатом).

Помимо обычной световой микроскопии изучение клетки проводится с помощью темнопольной, фазово-контрастной, флюоресцентной и некоторых других видов световой микроскопии.

Темнопольное микроскопирование. Темнопольный микроскоп в отличие от обычного снабжен специальным конденсором. В конденсоре имеется темная диафрагма, не пропускающая свет в центр поля зрения, так что объект освещается косым пучком. При этом в объектив микроскопа попадают только лучи, отраженные и рассеянные от поверхности объекта, что повышает контрастность некоторых структур и делает их видимыми. Темнопольную микроскопию применяют для наблюдения ряда структур в живой клетке. В частности темнопольную микроскопию используют для определения частоты повреждений акросомы у спермиев сельскохозяйственных животных.

Фазовоконтрастное микроскопирование. Фазовоконтрастный микроскоп был сконструирован Фрицем Зернике в 1932 г. Фазовоконтрастная микроскопия является отличным методом прижизненного наблюдения за клетками. Ее используют для изучения многих органоидов клетки и хромосом во время деления. В конденсоре фазовоконтрастного микроскопа имеется кольцевая диафрагма, через которую свет проходит в виде полого конуса, а остальные лучи поглощаются. В объективе находится фазовая пластинка, представляющая собой прозрачный диск, имеющий выемку. Форма и размер выемки совпадают с прямым изображением кольцевой диафрагмы. При помещении объекта между конденсором и объективом в задней фокальной плоскости объектива, кроме прямого изображения, появляется несколько перекрывающих друг друга дифракционных изображений диафрагмы. Выемка фазовой пластинки рассчитывается так, чтобы оба пучка лучей, образующих прямое и дифракционное изображение, отличались по оптическому пути на четверть длины волны. Таким образом, фазовые различия, которые раньше не улавливались глазом, превращаются в различия интенсивности и становятся видимыми.

Флуоресцентная микроскопия является хорошим методом прижизненного наблюдения клеток. Флуоресцентный микроскоп позволяет наблюдать флуоресценцию (свечение) ряда веществ и структур клетки. Флуоресценция объекта возбуждается ультрафиолетовыми или сине-фиолетовыми лучами от специальных источников света. Излучение объекта всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет. Объект рассматривается в лучах его флуоресценции, которые отделяются от лучей возбуждающего света при помощи светофильтров. Ряд веществ (некоторые витамины, пигменты, липиды) обладают собственной (первичной) флуоресценцией. Вещества клетки, не обладающие этим свойством, предварительно окрашивают специальными красителями – флюорохромами , а затем наблюдают вторичную флуоресценцию.

Электронное микроскопирование. В электронном микроскопе для построения изображения вместо света используют поток электронов в вакууме. Фокусировка электронного пучка производится не линзами, как в световом микроскопе, а электромагнитными полями. Изображение наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты при электронной микроскопии находятся в глубоком вакууме, поэтому предварительно их подвергают фиксации и специальной обработке. По этой причине с помощью электронного микроскопа можно изучать только убитые клетки. Кроме того, они должны быть очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается объектом. В этой связи в качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, помещенные на тончайшие пленки. В трансмиссионном (просвечивающем) электронном микроскопе электроны проходят сквозь объект так, как в световом микроскопе через него проходит свет. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.). В сканирующем электронном микроскопе точно сфокусированный пучок электронов движется взад и вперед по поверхности образца. При этом отраженные от его поверхности электроны собираются и формируют изображение. Преимущество использования этой разновидности электронного микроскопа заключается в том, что создается трехмерное изображение. Поэтому сканирующая электронная микроскопия используется для изучения поверхности объектов. Электронный микроскоп имеет разрешающую способность около 1–2 нм. Этого достаточно для изучения макромолекул.

Авторадиография. Этот метод основан на применении меченными радиоактивными изотопами веществ. Если добавить в среду радиоактивный изотоп, поглощаемый клетками в процессе метаболизма, то его внутриклеточную локализацию можно впоследствии выявить с помощью авторадиографии. При использовании этого метода тонкие срезы клеток помещают на пленку. Пленка темнеет под теми местами, где находятся радиоактивные изотопы. В качестве изотопов используют фосфор ( P 32 ), железо (Fe 59 ), серу (S 35 ), углерод (С 14), тритий ( H 3 ) и др.

Центрифугирование. Начало методу было положено в 1926 г., когда Сведберг изобрел аналитическую центрифугу и использовал ее для определения молекулярной массы гемоглобина. Перед центрифугированием необходимо разрушить клеточную оболочку. Разрушение проводят, используя ультразвуковую вибрацию, осмотический шок, измельчение, продавливание через маленькое отверстие. При осторожном разрушении некоторые органоиды клетки сохраняются в интактном состоянии. Измельченные ткани с разрушенными клеточными оболочками помещают в пробирки и вращают в центрифуге с большой скоростью. Метод основан на том, что различные клеточные органоиды имеют разную массу и плотность. Более плотные органоиды осаждаются в пробирке при низких скоростях центрифугирования, менее плотные - при высоких. Эти слои изучают отдельно. Так ядра и неразрушенные клетки, быстро оседают при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высокой скорости выпадают в осадок митохондрии, а еще при более высоких скоростях и длительных периодах центрифугирования осаждаются рибосомы. Обычно такие очищенные компоненты сохраняют высокую биохимическую активность.

Метод культуры клеток и тканей состоит в том, что из одной или нескольких клеток на специальной питательной среде можно получить группу однотипных клеток. Этот метод имеет колоссальные перспективы не только для цитологии, но и для медицины, сельского хозяйства. Так клеточные культуры используют для выяснения закономерностей дифференцировки, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, трансформации и др. В биотехнологии клеточные культуры применяют при производстве вакцин и биологически активных веществ. В фармакологии их используют в качестве тест-объектов при испытании новых лекарственных препаратов. Основоположником этого метода является американский зоолог и эмбриолог Р. Гаррисон (1879-1959), которому в 1907 г. удалось культивировать клетки саламандры в искусственной среде вне организма. Впоследствии многие типы растительных и животных клеток выращивались in vitro , и этот метод позволил сделать ряд важных открытий в области физиологии клеток. Выражение in vitro (по-латыни «в стекле) означает, что исследование проведено не на живом организме, а в стеклянном сосуде того или иного рода. В противоположность первому выражению in vivo указывает на эксперимент с целым, живым организмом. Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма, называют первичными культурами. В большинстве случаев клетки первичной культуры можно перенести из культуральной чашки и использовать для получения большого количества вторичных культур. Клеточные линии можно использовать для получения кло6нов, которые происходят из одиночной клетки-предшественника. Можно осуществить слияние клеток одного или разных видов. Чтобы добиться слияния, клетки подвергают воздействию вирусных ферментов или полиэтиленгликоля. Эти вещества повреждают плазматическую мембрану клеток, что приводит к образованию клетки с двумя отдельными ядрами. Спустя определенное время такая клетка делится путем митоза, образуя гибридную клетку. В гибридной клетке все хромосомы объединены в одно большое ядро. Такие гибридные клетки можно клонировать и получить гибридную клеточную линию. Используя этот метод, удалось получить гибридные клетки человека и мыши, человека и жабы. Поученные гибридные клетки нестабильны и после многочисленных клеточных делений теряют большинство хромосом либо одного, либо другого вида. Конечный продукт становится, например, по существу клеткой мыши, где человеческие гены отсутствуют или имеются лишь в незначительном количестве. Поэтому эту методику с успехом можно использовать для картирования генов в хромосомах человека.

Микрургия. Этот метод основан на использовании микроманипуляторов. Они представляют собой приборы, обеспечивающие точные движения микроинструментов в клетке. Микроинструменты обычно делают из стекла. Их форма определяется задачами микрургических операций. Они могут быть в виде игл, шприцев, пипеток, шпателей, скальпелей и т. д. С помощью микроманипуляторов над клетками можно производить разнообразные операции (инъекции в клетку веществ, извлечение и пересадка ядер, локальное повреждение клеточных структур и т.д.). Особенно хорошо микрургические операции удаются на крупных клетках (одноклеточные, яйцеклетки амфибий, клетки зародышей некоторых животных). Так клетку амебы удается разделить на три основных компонента – мембрану, цитоплазму и ядро. Затем эти компоненты можно вновь собрать и получить живую клетку. Таким путем могут быть получены искусственные клетки, состоящие из компонентов разных видов амеб. Микрургические операции производятся не только микроинструментами, но сфокусированным пучком ультрафиолетовых лучей (лучевой микроукол).

Кроме названных методов при изучении клетки используют хроматографию, электрофорез и некоторые другие. Новые методы позволили достичь огромных успехов в изучении клетки. Однако следует помнить, что классические методы цитологии, основанные на фиксации, окрашивании и изучении клеток под световым микроскопом, по-прежнему сохраняют практическое значение.

Лекция 1.

Структура растительной клетки

Световая микроскопия

Электронная микроскопия

Дифференциальное центрифугирование

Метод культуры клеток

Клетка является основной структурной и функциональной единицей живых организмов.

Клетки эмбриональных (неспециализированных) тканей животных и растений в общем плане строения очень сходны. Именно это обстоятельство в свое время явилось причиной для появления и развития клеточной теории. Морфологические различия проявляются уже в дифференцированных клетках специализированных тканей растений и животных. Особенности строения растительной клетки, как и растения в целом, связаны с образом жизни и способом питания. Большинство растений ведет относительно неподвижный (прикрепленный) образ жизни. Специфика питания растений состоит в том, что вода и питательные вещества: органические и неорганические, находятся вокруг в рассеянном виде и растению приходится их поглощать путем диффузии. Кроме того, зеленые растения на свету осуществляют автотрофный способ питания. Благодаря этому, эволюционно сложились некоторые специфические особенности строения и роста растительных клеток. К ним относятся:

	прочная полисахаридная клеточная стенка , окружающая клетку и составляющая жесткий каркас;
	пластидная система , возникшая в связи с автотрофным типом питания;
	вакуолярная система , которая в зрелых клетках обычно представлена крупной центральной вакуолью, занимающей до 95% объема клетки и играющей важную роль в поддержании тургорного давления ;
	особый тип роста клеток путем растяжения (за счет увеличения объема вакуоли);
	тотипотентность , то есть возможность регенерации полного растения из дифференцированной растительной клетки;
	есть еще одна деталь, отличающая растительные клетки от клеток животных: у растений при делении клеток не выражены центриоли .

Строение клетки в самом общем виде известно вам еще из курса общей биологии и при подготовке к вступительным экзаменам вы достаточно хорошо штудировали эту тему. Эта тема в разных аспектах рассматривается и в соответствующих университетских курсах (например, зоология беспозвоночных, низшие растения). Кроме того, более детальное знакомство с клеткой на высоком уровне предстоит в курсе "цитология". Нам же важно акцентировать внимание на специфических особенностях строения растительной клетки, причем преимущественно клетки высшего растения.

При самом поверхностном рассмотрении структуры типичной растительной клетки в ее составе обнаруживаются три основных компонента: (1) клеточная стенка , (2) вакуоль, занимающая в зрелых клетках центральное положение и заполняющая практически весь их объем и (3) протопласт , оттесняемый вакуолью к периферии в виде постенного слоя. Именно эти компоненты обнаруживаются на малом увеличении светового микроскопа. Причем клеточная оболочка и вакуоль являются продуктами жизнедеятельности протопласта.

Живое тело клетки? протопласт состоит из органоидов, погруженных в гиалоплазму . К организмам клетки относятся: ядро, пластиды, митохондрии, диктиосомы, эндоплазматический ретикулум, микротельца и др. Гиалоплазма с органеллами за вычетом ядра составляет цитоплазму клетки.

Для выражения размеров субклеточных структур используются определенные меры длины: микрометр и нанометр .

Микрометр в системе единиц измерения СИ величина, равная 10 -6 м . Говоря другими словами, микрометр (аббревиатура мкм) составляет 1/1000000 долю метра и 1/1000 долю миллиметра. 1 мкм = 10 -6 м . Старое название этой меры микрон .

Нанометр в той же системе представляет миллионную долю миллиметра 1 нм = 10 -9 м и тысячную долю микрометра.

Размеры и форма растительных клеток варьируются в широком диапазоне. В типичном случае размеры клеток высшего растения колеблются в пределах 10 - 300 мкм. Правда, встречаются клетки - гиганты, например, клетки сочной мякоти плодов цитрусовых составляют в поперечнике несколько миллиметров или чрезвычайно длинные лубяные волокна у крапивы достигают 80 мм длины при микроскопической толщине.

По форме различают изодиаметрические клетки, у которых линейные размеры во всех направлениях равны или отличаются незначительно (то есть длина, ширина и высота этих клеток сопоставимы). Такие клетки называют паренхимными (паренхима) .

Сильно вытянутые клетки, у которых длина во много раз (иногда в сотни и тысячи) превышает высоту и ширину, называют прозенхимными (прозенхима) .

Методы изучения растительной клетки

Для изучения клеток разработано и применяется множество методов, возможности которых определяют уровень наших знаний в этой области. Успехи в изучении биологии клетки, включая наиболее выдающиеся достижения последних лет, как правило, связаны с применением новых методов. Поэтому для более полного понимания клеточной биологии необходимо иметь хотя бы некоторое представление о соответствующих методах исследования клетки.

Световая микроскопия

Самым древним и, вместе с тем, наиболее распространенным методом изучения клетки является микроскопия. Можно сказать, что и начало изучения клетки было положено изобретением светового оптического микроскопа.

Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм. Это означает, что если вы смотрите на две линии, которые находятся друг от друга на расстоянии меньше 0,1 мм, они сливаются в одну. Чтобы различить структуры, расположенные более тесно, применяют оптические приборы, например, микроскоп.

Но возможности светового микроскопа не безграничны. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, то есть оптический микроскоп может быть использован только для изучения таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длиной волны светового излучения. Лучший световой микроскоп имеет разрешающую способность около 0.2 мкм (или 200 нм), то есть примерно в 500 раз улучшает человеческий глаз. Теоретически построить световой микроскоп с большим разрешением невозможно.

Многие компоненты клетки близки по своей оптической плотности и без специальной обработки практически не видны в обычный световой микроскоп. Для того, чтобы сделать их видимыми, используют различные красители , обладающие определенной избирательностью.

В начале XIX в. Возникла потребность в красителях для окрашивания текстильных тканей, что в свою очередь вызвало ускоренное развитие органической химии. Оказалось, что некоторые из этих красителей окрашивают и биологические ткани и, что было уж совсем неожиданно, часто предпочтительно связываются с определенными компонентами клетки. Использование таких избирательных красителей дает возможность более тонко исследовать внутреннее строение клетки. Приведем лишь несколько примеров:

	краситель гематоксилин окрашивает некоторые компоненты ядра в синий или фиолетовый цвет;
	после обработки последовательно флороглюцином и затем соляной кислотой одревесневшие оболочки клеток становятся вишнево - красными;
	краситель судан III окращивает опробковевшие клеточные оболочки в розовый цвет;
	слабый раствор йода в йодистом калии окрашивает крахмальные зерна в синий цвет.

Для проведения микроскопических исследований большую часть тканей перед окраской фиксируют . После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, а структура клетки стабилизируется. Одним из наиболее распространенных фиксаторов в ботанике является этиловый спирт.

Фиксация и окрашивание не единственные процедуры, используемые для приготовления препаратов. Толщина большинства тканей слишком велика, чтобы их сразу можно было наблюдать при высоком разрешении. Поэтому выполняют тонкие срезы на микротоме . В этом приборе использован принцип хлеборезки. Для растительных тканей изготавливают чуть более толстые срезы, чем для животных, поскольку клетки растений обычно крупнее. Толщина срезов растительных тканей для световой микроскопии около 10 мкм - 20 мкм. Некоторые ткани слишком мягкие, чтобы из них сразу же можно было получить срезы. Поэтому после фиксации их заливают в расплавленный парафин или специальную смолу, которые пропитывают всю ткань. После охлаждения образуется твердый блок, который затем режется на микротоме. Правда, для растительных тканей заливка применяется значительно реже, чем для животных. Это объясняется тем, что растительные клетки имеют прочные клеточные стенки, составляющие каркас ткани. Особенно прочны одревесневшие оболочки.

Однако заливка может нарушить структуру клетки, поэтому применяют еще и другой метод, где эта опасность уменьшена? быстрое замораживание. Здесь можно обойтись без фиксации и заливки. Замороженную ткань режут на специальном микротоме (криотоме).

Замороженные срезы, приготовленные таким способом, имеют явное преимущество, поскольку в них лучше сохраняются особенности естественной структуры. Однако их труднее готовить, а присутствие кристаллов льда все же нарушает некоторые детали.

Микроскопистов всегда беспокоила возможность потери и искажения некоторых компонентов клетки в процессе фиксации и окраски. Поэтому полученные результаты проверяют другими методами.

Весьма заманчивой представлялась возможность исследовать под микроскопом живые клетки, но так, чтобы более отчетливо проявились детали их строения. Такую возможность дают особые оптические системы: фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Хорошо известно, что световые волны, подобно волнам воды, могут интерферировать друг с другом, увеличивая или уменьшая амплитуду результирующих волн. В обычном микроскопе, проходя через отдельные компоненты клетки, световые волны меняют свою фазу, хотя человеческий глаз этих различий не улавливает. Но за счет интерференции можно преобразовать волны, и тогда разные компоненты клетки можно отличить друг от друга под микроскопом, не прибегая к окрашиванию. В этих микроскопах используют 2 пучка световых волн, которые взаимодействуют (налагаются) друг на друга, усиливая или уменьшая амплитуду волн, поступающих в глаз от разных компонентов клетки.

Электронная микроскопия

Возможности светового микроскопа, как уже было сказано, ограничиваются длиной волны видимого света. Его максимальная разрешающая способность составляет примерно 0.2 мкм.

Большой шаг вперед был сделан в микроскопии в 20-х годах нашего века, когда было обнаружено, что соответствующим образом подобранные электромагнитные поля можно использовать подобно линзам для фокусирования пучков электронов.

Длина волны электрона значительно меньше, чет длина волны видимого света, и если вместо света использовать электроны, то предел разрешения микроскопа может быть заметно снижен.

На основе всего этого был создан микроскоп, в котором вместо света используется пучок электронов. Первый электронный микроскоп сконструировали в 1931 г. Кнолл и Руска в Германии. Прошло, однако, много лет, прежде чем появилась возможность изучать при помощи этого микроскопа срезы тканей. Лишь в 50-е годы были разработаны методы изготовления срезов, обладающих необходимыми качествами. С этого времени началась новая эра микроскопии, и в науку буквально хлынул поток информации о тонком строении клеток (ультраструктуре клеток).

Сложности электронной микроскопии состоят в том, что для исследования биологических образцов необходима специальная обработка препаратов.

Первая трудность заключается в том, что электроны обладают очень ограниченной проникающей способностью, поэтому следует изготавливать ультратонкие срезы, толщиной 50 - 100 нм. Для того, чтобы получить столь тонкие срезы, ткани сперва пропитывают смолой: смола полимеризуется и формирует твердый пластмассовый блок. Затем с помощью острого стеклянного или алмазного ножа срезы нарезают на специальном микротоме.

Есть еще одна трудность: при прохождении через биологическую ткань электронов не получается контрастного изображения. Для того, чтобы получить контраст, тонкие срезы биологических образцов пропитывают солями тяжелых металлов.

Существует два основных типа электронных микроскопов. В трансмиссионном (просвечивающем) микроскопе пучок электронов, проходя сквозь специально подготовленный образец, оставляет его изображение на экране. Разрешающая способность современного трансмиссионного электронного микроскопа почти в 400 раз больше светового. Эти микроскопы имеют разрешающую способность около 0,5 нм (для сравнения: диаметр атома водорода около 0,1 нм).

Несмотря на столь высокое разрешение, просвечивающие электронные микроскопы имеют крупные недостатки:

Трехмерное (объемное) изображение получают с помощью сканирующего электронного микроскопа (ЭМ). Здесь луч не проходит через образец, а отражается от его поверхности.

Исследуемый образец фиксируют и высушивают, после чего покрывают тонким слоем металла? операция называется оттенением (образец оттеняют).

В сканирующем ЭМ сфокусированный электронный пучок направляется на образец (образец сканируют). В результате металлическая поверхность образца испускает вторичные электроны слабой энергии. Они регистрируются и преобразуются в изображение на телевизионном экране. Максимальное разрешение сканирующего микроскопа невелико, около 10 нм, но зато изображение получается объемным.

Метод замораживания-скалывания

Принципиально новые возможности электронной микроскопии открылись сравнительно недавно, после разработки метода "замораживания - скалывания". С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе.

При обычном замораживании в клетках образуются кристаллики льда, которые заметно искажают их структуру. Во избежание этого клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (- 196 С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций.

Замороженный блок раскалывают лезвием ножа (отсюда и название метода). Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. Однако весь фокус состоит в том, что напыление производится под углом к поверхности образца. Это очень важный момент. Появляется эффект тени, изображение выглядит объемным.

В трансмиссионном микроскопе электронный луч способен проникнуть только через очень тонкие срезы. Обычная толщина оттененных образцов чрезмерно велика, поэтому органическую материю, подстилающую слой металла, необходимо растворить. В результате остается тонкая металлическая реплика (или отпечаток) с поверхности образца. Реплику и используют в трансмиссионном микроскопе.

Этот метод предоставил, например, уникальную возможность наблюдать внутреннее строение мембран клетки.

Дифференциальное центрифугирование

Помимо микроскопии, другим основным и широко распространенным методом изучения клеток является дифференциальное центрифугирование или фракционирование.

Принцип метода состоит в том, что при центрифугировании развивается центробежная сила, под воздействием которой взвешенные частицы оседают на дно центрифужной пробирки.

После того, как в начале 40-х годов начали использовать ультрацентрифугу, разделение клеточных компонентов стало вполне реальным.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, их необходимо разрушить - разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Для этого используют различные методы: ультразвуковую вибрацию, продавливание через маленькие отверстия или самое обычное измельчение растительных тканей пестиком в фарфоровой ступе. При осторожном применении методов разрушения можно сохранить некоторые органеллы целыми.

При высокоскоростном центрифугировании крупные компоненты клетки (например, ядра) быстро оседают (седиментируют), при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высоких скоростях в осадок выпадают более мелкие компоненты, такие как хлоропласты и митохондрии.

То есть при центрифугировании компоненты клетки распадаются на фракции: крупные и мелкие, поэтому второе название метода? фракционирование. При этом, чем выше скорость и длительность цетрифугирования, тем мельче полученная фракция.

Скорость седиментации (осаждения) компонентов выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S.

Этапы дифференциального центрифугирования: низкая скорость (ядра, цитоскелет), средняя скорость (хлоропласты), высокая скорость (митохондрии, ризосомы, микротельца), очень высокая скорость (рибосомы).

Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов. Так, использование именно этого метода принесло триумфальный успех в изучении биосинтеза белка.

Ну и вообще, чистые фракции внутриклеточных структур можно подвергать любым видам анализа.

Метод культуры клеток

Клетки животных, выделенные в культуру (то есть помещенные на питательную среду), погибают после определенного числа делений, поэтому считаются трудным и неудобным объектом для культивирования. Другое дело клетки растений, способные делиться неограниченное число раз.

Метод культуры клеток облегчает изучение механизмов клеточной дифференциации у растений.

На питательной среде клетки растений образуют однородную недифференцированную клеточную массу? каллус. Каллус обрабатывают гормонами. Под влиянием гормонов клетки каллуса могут давать начало разным органам.

Строение и жизнедеятельность растительной клетки.

1. Строение растительной клетки: целлюлозная оболочка, плазматическая мембрана, цитоплазма с органоидами, ядро, вакуоли с клеточным соком. Наличие пластид - главная особенность растительной клетки.

2. Функции клеточной оболочки - придает клетке форму, защищает от факторов внешней среды.

3. Плазматическая мембрана - тонкая пленка, состоит из взаимодействующих молекул липидов и белков, отграничивает внутреннее содержимое от внешней среды, обеспечивает транспорт в клетку воды, минеральных и органических веществ путем осмоса и активного переноса, а также удаляет вредные продукты жизнедеятельности.

4. Цитоплазма - внутренняя полужидкая среда клетки, в которой расположено ядро и органоиды, обеспечивает связи между ними, участвует в основных процессах жизнедеятельности.

5. Эндоплазматическая сеть - сеть ветвящихся каналов в цитоплазме. Она участвует в синтезе белков, липидов и углеводов, в транспорте веществ. Рибосомы - тельца, расположенные на ЭПС или в цитоплазме, состоят из РНК и белка, участвуют в синтезе белка. ЭПС и рибосомы - единый аппарат синтеза и транспорта белков.

6. Митохондрии - органоиды, отграниченные от цитоплазмы двумя мембранами. В них с участием ферментов окисляются органические вещества и синтезируются молекулы АТФ. Увеличение поверхности внутренней мембраны, на которой расположены ферменты, за счет крист. АТФ - богатое энергией органическое вещество.

7. Пластиды (хлоропласты, лейкопласты, хромопласты), их содержание в клетке - главная особенность растительного организма. Хлоропласты - пластиды, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, который поглощает энергию света и использует ее на синтез органических веществ из углекислого газа и воды. Отграничение хлоропластов от цитоплазмы двумя мембранами, многочисленные выросты - граны на внутренней мембране, в которых расположены молекулы хлорофилла и ферменты.

8. Комплекс Гольджи - система полостей, отграниченных от цитоплазмы мембраной. Накапливание в них белков, жиров и углеводов. Осуществление на мембранах синтеза жиров и углеводов.

9. Лизосомы - тельца, отграниченные от цитоплазмы одной мембраной. Содержащиеся в них ферменты ускоряют реакцию расщепления сложных молекул до простых: белков до аминокислот, сложных углеводов до простых, липидов до глицерина и жирных кислот, а также разрушают отмершие части клетки, целые клетки.

10. Вакуоли - полости в цитоплазме, заполненные клеточным соком, место накопления запасных питательных веществ, вредных веществ; они регулируют содержание воды в клетке.

11. Клеточные включения - капли и зерна запасных питательных веществ (белки, жиры и углеводы).

12. Ядро - главная часть клетки, покрытая снаружи двухмембранной, пронизанной порами ядерной оболочкой. Вещества поступают в ядро и удаляются из него через поры. Хромосомы - носители наследственной информации о признаках организма, основные структуры ядра, каждая из которых состоит из одной молекулы ДНК в соединении с белками. Ядро - место синтеза ДНК, иРНК, рРНК.

Задание №1.

В основе разделения органоидов методом центрифугирования лежат их различия по

1. Строению и составу

2. Выполняемым функциям

3. Плотности и массе

4. Расположению в цитоплазме

Объяснение: при центрифугировании самые плотные (тяжелые) частицы опускаются вниз, то есть таким методом можно разделить органоиды по плотности и массе. Правильный ответ - 3.

Задание №2.

Что является структурно-функциональной единицей строения организмов всех царств?

1. ДНК

2. Ядро

3. Клетка

4. Хромосома

Объяснение: следую клеточной теории, структурно-функциональной единицей всего живого является клетка. Правильный ответ - 3.

Задание №3.

Какие вещества выполняют в клетке информационную функцию?

1. Нуклеиновые кислоты

2. Белки

3. АТФ

4. Сборка белка

Объяснение: как мы знаем, за информацию в клетке отвечают нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК). ДНК хранит генетическую информацию, а РНК способствует ее воспроизведению. Правильный ответ - 1.

Задание №4.

Какой процесс лежит в основе образования двух хроматид перед делением клетки?

1. Репликация ДНК

2. Транскрипция

3. Синтез РНК

4. Сборка белка

Объяснение: в основе образования двух хроматид лежит процесс репликации ДНК (синоним репликации - копирование). Правильный ответ - 1.

Задание №5.

Для каких организмов характерен хемосинтез?

1. Цианобактерий

2. Бактериофагов

3. Эукариот

4. Серобактерий

Объяснение: хемосинтез - процесс образования органических веществ из неорганических при помощи окисления химических веществ (как органических, так и неорганических). Хемотрофами могут быть только бактерии. Правильный ответ - 4.

Задание №6.

Какие животные имеют прямое постэмбриональное развитие?

1. Млекопитающие

2. Плоские черви

3. Земноводные

4. Бабочки

Объяснение: у насекомых различают развитие с полным и неполным превращением, у плоских червей тоже сложный цикл развития, земноводные развиваются через стадию головастика, а млекопитающие рождаются сразу похожими на взрослое животное. Правильный ответ - 1.

Задание №7.

Видовые признаки организмов сохраняются благодаря

1. Наследственности

2. Доминантности

3. Обмену веществ

4. Адаптации

Объяснение: видовые признаки сохраняются благодаря передаче данных признаков из поколения в поколение, то есть посредством наследственности. Правильный ответ - 1.

Задание №8.

У темноволосых родителей родилась светловолосая дочь. Определите генотип родителей, если известно, что темный цвет волос доминирует над светлым.

1. Аа х АА

2. Аа х Аа

3. Аа х аа

4. Аа х АА

Объяснение: такая ситуация возможна только если оба родителя гетерозиготны по этому признаку (Аа). В таком случае вероятность рождения светловолосого ребенка равна 25%. Правильный ответ - 2.

Задание №9.

Способность организмов приобретать новые признаки и свойства называют

1. Наследственностью

2. Саморегуляцией

3. Изменчивостью

4. Самовоспроизведением

Объяснение: как мы сказали в задании №7, наследственность отвечает за передачу признаков из поколения в поколение, а изменчивость способствует приобретению организмами новых признаков. Правильный ответ - 3.

Задание №10.

Микориза - это

2. Симбиоз мицелия с корнями растений

3. Болезнь растения, вызванная грибами

4. Гифы гриба, на которых развивается плодовое тело

Объяснение: микориза - это симбиоз гиф гриба и корней дерева. При этом дерево обеспечивается минеральными веществами, так как гриб разлагает органические вещества до неорганических, а гриб обеспечивается органическими веществами, так как дерево является фототрофом, то есть создает органические вещества из неорганических при помощи солнечного света. Правильный ответ - 2.

Задание №11.

На каком рисунке изображена клетка, которая не может делиться?

Объяснение: клетка, которая не может делиться изображена на рисунке 2, так как почти всю клетку занимает вакуоль, это говорит о том, что клетка уже достаточно старая, а старые клетки не делятся. Правильный ответ - 2.

Задание №12.

Зеленые водоросли относят к царству растений, так как они

1. В клетках содержат хлорофилл

2. Являются индикаторами загрязнения воды и почвы

3. Имеют клеточное строение

4. Выделяют в атмосферу углекислый газ в процессе дыхания

Объяснение: водоросли (не только зеленые) относят к растениям, так как они обладают рядом признаков, характерным растениям (неподвижны, автотрофны, имеют пигменты и т.д.), в том числе содержат хлорофилл. Правильный ответ - 1.

Задание №13.

Взрослая особь человеческой аскариды обитает в

1. Желудке

2. Надпочечниках

3. Кишечнике

4. Легких

Объяснение: рассмотрим жизненный цикл аскариды

Как видно из схемы - половозрелые взрослые особи обитают в кишечнике человека. Правильный ответ - 3.

Задание №14.

Обыкновенный дельфин, погружаясь в морские глубины, расходует кислород, который содержится в

1. Легких

2. Полостях тела

3. Воздушных мешках

4. Жабрах

Объяснение: дельфин является вторичноводным млекопитающим, то есть предки дельфина жили на суше. И, как и любое другое млекопитающее, в своей дыхательной системе имеет легкие, которыми и дышит. У него нет ни воздушных мешков (как у птиц), ни жабр (как у рыб) и в полостях тела воздух тоже не накапливается. Правильный ответ - 1.

Задание №15.

Ротовая полость человека выстлана тканью, в которой клетки

1. Соединены друг с другом отростками

2. Плотно прилегают друг к другу

3. Имеют поперечную исчерченность

4. Располагаются рыхло

Объяснение: ротовая полость человека выстлана многослойный неороговевающим эпителием. Одной из характеристик эпителия является очень низкое содержание межклеточного вещества, то есть клетки плотно прилегают друг к другу. Правильный ответ - 2.

Задание №16.

В сердце человека створчатые клапаны открываются в

1. Предсердия

2. Вену

3. Желудочки

4. Аорту

Объяснение: створчатые клапаны расположены в сердце между предсердиями и желудочками, поэтому и открываются они в желудочки. Правильный ответ - 3.

Задание №17.

Человеку, работа которого требует длительного напряжения зрения, необходимо дополнительно употреблять витамин

1. А

2. В

3. С

4. D

Объяснение: огромное значение для фоторецепции и для зрения в целом имеет нормальное содержание витамина А. Он содержится в различных окрашенных продуктах - моркови, перцах, а также в рыбе, яйцах, молоке, печени и др. Правильный ответ - 1.

Задание №18.

Гуморальная регуляция осуществляется с помощью

1. Нервных импульсов, возникающих в рецепторах

2. Веществ, образующихся в железах внутренней секреции

3. Белков, содержащихся в пище

4. Деятельности головного и спинного мозга

Объяснение: гуморальная, она же гормональная, регуляция осуществляется при помощи гормонов, циркулирующих в крови. Гормоны выделяются железами внутренней секреции. Правильный ответ - 2.

Задание №19.

После травмы головы у человека нарушилась координация движения из-за нарушения работы

1. Мозжечка

2. Переднего мозга

3. Среднего мозга

4. Продолговатого мозга

Объяснение: за координацию движений отвечает мозжечок, также он регулирует мышечный тонус, равновесие и отвечает за мышечную память. Правильный ответ - 1.

Задание №20.

Скрещиванию разных видов синиц, обитающих в пределах одного лесного массива, препятствует

1. Разных хромосомный набор

2. Различие потребляемых кормов

3. Нарушение светового режима

4. Отсутствие мест для гнездования

Объяснение: скрещивание разных видов (не только синиц) невозможно из-за различий в хромосомном наборе организмов. Правильный ответ - 1.

Задание №21.

Стабилизирующая форма естественного отбора способствует

1. Полному вытеснению редких рецессивных мутаций

2. Сохранению в популяции среднего значения признака

3. Формированию новых признаков

4. Увеличению внутривидового разнообразия

Объяснение: стабилизирующая форма естественного отбора сохраняет особей популяции со средним значением признака, выбраковывая организмы с отклонениями от нормы. Правильный ответ - 2.

Задание №22.

Копчиковая кость, аппендикс, остаток третьего века в углу глаза человека - это

1. Аналогичные органы

2. Гомологичные органы

3. Атавизмы

4. Рудименты

Объяснение: все перечисленные признаки - это органы, оставшиеся от предков и утратившие свои функции. Такие органы называют рудиментарными. Правильный ответ - 4.

Задание №23.

Какой критерий вида служит главным доказательством родства человеческих рас?

1. Морфологический

2. Географический

3. Генетический

4. Физиологический

Объяснение: сейчас, в основном, для доказательства родства организмов или определения принадлежности к определенной группе, использую различные генетические методы. И, в зависимости от процентного соотношения гомологичности ДНК, определяют родство. Так доказали и родство человеческих рас. Правильный ответ - 3.

Задание №24.

Отношения каких организмов служат примером симбиоза?

1. Клеща и собаки

2. Сосны и масленка

3. Щуки и карася

4. Растения росянки и насекомого

Задание №25.

Роль организмов-консументов в экосистеме состоит в

1. Установлении симбиоза с растениями

2. Использовании ими солнечной энергии

3. Использовании неорганических веществ

4. Преобразовании органического вещества

Объяснение: консументы является вторым звеном в пищевой цепи после продуцентов (они превращают неорганические вещества в органические), то используют созданные продуцентами органические вещества. Правильный ответ - 4.

Задание №26.

Образование залежей каменного угля в недрах Земли связано преимущественно с развитием древних

1. Водорослей

2. Покрытосеменных

3. Моховидных

4. Папоротникообразных

Объяснение: залежи каменного угля образовались из остатков разложения различных древних растений, в основном, папоротникообразных. Правильный ответ - 4.

Задание №27.

Четвертичная структура молекулы гемоглобина представляет собой

1. Глобулу из одной полипептидной цепи

2. Двойную полипептидную спираль

3. Несколько соединенных полипептидных цепей

4. Последовательность аминокислот в полипептидной цепи

Объяснение: чтобы представить четвертичную структуру, посмотрим на картинку

Как мы видим, четвертичная структура представляет собой несколько свернутых полипептидных цепочек, они могут быть соединены ионом металла (например, гемоглобин). Правильный ответ - 3.

Задание №28.

Каковы конечные продукты подготовительного этапа энергетического обмена?

1. Углекислый газ и вода

2. Мочевина и мочевая кислота

3. Триглицериды и аммиак

4. Аминокислоты и глюкоза

Объяснение: на подготовительном этапе энергетического обмена происходит расщепление сложных органических молекул - полимеров до мономером, то есть белки расщепляются до аминокислот, полисахариды до моносахаридов и т.д. Вся полученная при этом энергия рассеивается в виде тепла. Правильный ответ - 4.

Задание №29.

Анализ стадий эмбриогенеза позвоночных животных служит основой для изучения их

1. Особенностей размножения

2. Уровня обмена веществ

3. Модификационной изменчивости

4. Эволюционного происхождения

Объяснение: биогенетический закон гласит: онтогенез - повторение филогенеза, то есть в процессе развития (эмбрионального) организм повторяет все этапы эволюции, через которые проходили его предки. Правильный ответ - 4.

Задание №30.

Ускорение роста культурных растений и увеличение их биомассы за счет регулярного полива и подкормки - это изменчивость

1. Мутационная

2. Соотносительная

3. Модификационная

4. Комбинативная

Объяснение: это изменчивость, которая возникает у конкретного организма в конкретных условиях, при этом признаки не передаются потомству. Правильный ответ - 3.

Задание №31.

Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору, получают в селекции растений путем

1. Гетерозиса

2. Близкородственного скрещивания

3. Искусственного отбора

4. Искусственного мутагенеза

Объяснение: речь идет о получении полиплоидных организмов, то есть с увеличенным набором хромосом. Такой набор можно получить только при помощи искусственного мутагенеза. Правильный ответ - 4.

Задание №32.

Лишайники, в отличие от мхов,

1. Образуют ризоиды

2. Являются комплексными организмами

3. Вступают в симбиоз с корнями высших растений

4. Размножаются спорами

Объяснение: мхи - высшие растения, лишайники - симбиоз гриба и водоросли, то есть комплексные организмы. Правильный ответ - 2.

Задание №33.

Кровь по кровеносным сосудам человека течёт

1. Прерывисто - в соответствии с прерывистой работой желудочка

2. Толчками - вследствие пульсации сосудов

3. Прерывисто - вследствие задержки ее в органах

4. Непрерывно - вследствие эластичности стенок крупных артерий

Объяснение: сердце сокращается периодически, но за счет эластичности сосудов кровь в организме циркулирует непрерывно. Правильный ответ - 4.

Задание №34.

Что характерно для внешнего торможения рефлексов?

1. Формируется в нейронах вегетативной нервной системы

2. Образуется под влиянием условного раздражителя

3. Появляется при возникновении сильного раздражителя

4. Не развивается в нейронах функционирующей рефлекторной дуги

Объяснение: внешнее торможение - это торможение, возникающее под действием какого-то сильного внешнего раздражителя (например, боль, звук и т.д.). Правильный ответ - 3.

Задание №35.

Наиболее существенные и постоянные преобразования в биосфере вызывают

1. Климатические условия

2. Природные катаклизмы

3. Сезонные изменения в природе

4. Живые организмы

Объяснение: абиотические факторы постоянно влияют на нашу планету. В вопросе речь идет о биосфере, то есть о живой оболочке Земли, изменения в которой возникают из-за воздействия живых организмов друг на друга и на оболочку Земли. Правильный ответ - 4.

Задание №36.

Верны ли следующие суждения об обмене веществ?

А. Пластический обмен представляет собой совокупность реакций расщепления органических веществ в клетке, сопровождающихся выделением энергии.

Б. Хлорофилл растительных клеток улавливает солнечную энергию, которая аккумулируется в молекулах АТФ.

1. Верно только А

2. Верно только Б

3. Верны оба суждения

4. Оба суждения неверны

Объяснение: пластический обмен - процесс образование сложных молекул из простых (полимеров из мономеров). То есть процесс, обратный расщеплению. А второе утверждение верно. Правильный ответ - 2.

Задание №37.

Какие особенности строения и свойств воды определяют её функции в клетке?

1. Способность образовывать водородные связи

2. Наличие в молекулах макроэргических связей

3. Полярность молекулы

4. Высокая теплоемкость

5. Способность образовывать ионные связи

6. Способность выделять энергию при расщеплении

Объяснение: молекула воды полярная, между молекулами воды образуются водородные связи и она является внутренней средой организма и всех клеток, в которой происходят все реакции обмена, так же она является растворителем для большинства веществ. Таким образом, выбираем - 1, 3, 4.

Задание №38.

Какую функцию выполняют вставочные нейроны в нервной системе человека?

1. Передают нервные импульсы с двигательного нейрона в головной мозг

2. Передают нервные импульсы от рабочего органа в спинной мозг

3. Передают импульсы от спинного в головной мозг

4. Передают нервные импульсы к рабочим органам

5. Воспринимают нервные импульсы от чувствительных нейронов

6. Передают нервные импульсы двигательным нейронам

Объяснение: самая простая рефлекторная дуга состоит из чувствительного, вставочного и двигательного нейронов. Вставочные нейроны воспринимают импульс от чувствительных нейронов, передают сигнал из спинного мозга в головной и передают импульс к двигательным нейронам. Правильный ответ - 1, 3, 4.

Задание №39.

Какие из перечисленных примеров относят к ароморфозам?

2. Появление кровеносной системы у кольчатых червей

3. Возникновение теплокровности у млекопитающих

4. Расположение пальцев у дятлов - два вперед и два назад

5. Развитие сосущего ротового аппарата у насекомых

6. Появление четырехкамерного сердца у птиц

Объяснение: напомним, что ароморфоз - это такое изменение организма, которое способствует повышению его уровня организации. То есть это должно быть качественное (глобальное) изменение, такое, например, как появление кровеносной системы у кольчатых червей, возникновение теплокровности и появление четырехкамерного сердца. Остальные изменения является не глобальными, а частными. Правильный ответ - 2, 3, 6.

Задание №40.

Установите соответствие между признаком организма и царством, для которого он характерен.

Признак организма Царство

А. ДНК замкнута в виде кольца 1. Грибы

Б. По способу питания - автотрофы или гетеротрофы 2. Бактерии

В. Клетки имеют оформленное ядро

Г. ДНК имеет линейное строение

Д. В клеточное стенке имеется хитин

Е. Ядерное вещество расположено в цитоплазме

Объяснение: вспоминаем, что грибы - эукариоты, а бактерии - прокариоты, соответственно у прокариот отсутствует ядерная оболочка и все мембранные органеллы, кольцевая ДНК, по типу питания они могут быть как гетеро- так и автотрофами. То есть, правильный ответ - 221112.

Задание №41.

Установите соответствие между железой в организме человека и ее типом.

Железа Тип железы

А. Молочная 1. Внутренней секреции

Б. Щитовидная 2. Внешней секреции

В. Печень

Г. Потовая

Д. Гипофиз

Е. Надпочечники

Объяснение: железы внутренней секреции выделяют гормоны, то есть это такие железы, как щитовидная, гипофиз и надпочечники. Правильный ответ - 212211.

Задание №42.

Установите соответствие между характеристикой особи и ее генотипом.

Характеристика особи Генотип

А. Не дает расщепления в потомстве 1. Гомозиготный

Б. Имеет оба доминантных аллельных гена 2. Гетерозиготный

В. В потомстве происходит расщепление признаков

Г. Генотип содержит альтернативные гены

Д. Имеет оба рецессивных аллельных гена

Е. Образует разные типы гамет

Объяснение: гомозиготный генотип не дает расщепления в потомстве, имеет оба доминантных аллеля, не содержит альтернативных генов, имеет оба рецессивных аллеля и образует один тип гамет. Правильный ответ - 112212.

Задание №43.

Установите соответствие между характеристикой экосистем и их типом.

Характеристика Тип экосистем

А. Преобладают растения одного вида 1. Природная экосистема

Б. Обитает большое разнообразие видов 2. Агроэкосистема

В. Осуществляется саморегуляция

численности популяций

Г. Круговорот веществ незамкнутый

Д. Большую роль играет антропогенный фактор

Е. Пищевые цепи длинные

Объяснение: агроэкосистема включает один или несколько видов растений, имеет незамкнутый круговорот веществ, короткие пищевые цепи и человек играет большую роль в его жизнедеятельности. Правильный ответ - 211221.

Задание №44.

Установите последовательность процессов, происходящих при фагоцитозе.

1. Поступление мономеров в цитоплазму

2. Захват клеточной мембраной питательных веществ

3. Гидролиз полимеров до мономеров

4. Образование фагоцитозного пузырька внутри клетки

5. Слияние фагоцитозного пузырька с лизосомой

Объяснение: фагоцитоз - поглощение частиц пищи. Начинается с захвата клеточной мембраной питательных веществ, затем образуется фагоцитарный пузырек внутри клетки, потом он сливается с лизосомой, в лизосоме происходит гидролиз полимеров до мономеров и, в итоге, мономеры выходят в цитоплазму. Правильный ответ - 24531.

Задание №45.

Объясните, почему сокращение численности волков из-за отстрела в биоценозах тундры приводит к уменьшению запасов ягеля - корма северных оленей.

Объяснение: это происходит, потому что волки охотятся на северных оленей. Чем меньше волков, тем большей оленей, а олени кушаю ягель. При неконтролируемом размножении северных оленей запасы ягеля резко сократятся.

Задание №46.

Определите класс цветкового растения, изображенного на рисунке. Обоснуйте Ваш ответ. Назовите органы, обозначенные на рисунке буквами А и Б, и объясните их роль в жизни растения.

Объяснение: на рисунке представлена земляника (семейство розоцветные, класс двудольные, отдел покрытосеменные - наличие цветка и плода - признак покрытосеменных). А - цветок (орган полового размножения. Б - ус (столон) - видоизмененный побег. Земляника может размножаться и вегетативно при помощи столонов.

Задание №47.

Где расположен центр безусловно-рефлекторной регуляции кровяного давления человека? Чем различаются показатели кровяного давления в аорте и половых венах? Ответ поясните.

Объяснение: центр рефлекторно-рефлекторной регуляции кровяного давления расположен в продолговатом мозге (вообще большинство безусловных рефлексов контролируется спинным мозгом). В аорте давление более высокое, так как аорта расположена в начале большого круга кровообращения, а полыми венами большой круг кровообращения заканчивается, поэтому давление здесь наиболее низкое.

Задание №48.

В природе осуществляется круговорот кислорода. Какую роль играют в этом процессе живые организмы?

Объяснение: живые организмы дышат кислородом (кислород окисляет глюкозу при клеточном дыхании), при этом образуются углекислый газ и вода. Растения фиксируют углекислый газ в цикле Кальвина и выделяют кислород при фотосинтезе в качестве побочного продукта. А некоторые бактерии, осуществляющие хемосинтез, могут использовать кислород для окисления химических веществ.

Задание №49.

В биосинтезе фрагмента молекулы белка участвовали последовательно молекулы тРНК с антикодонами АГЦ, ГЦЦ, УЦА, ЦГА, АГА. Определите аминокислотную последовательность синтезируемого фрагмента молекулы белка и нуклеотидную последовательность участка двухцепочечной молекулы ДНК, в которой закодирована информация о первичной структуре фрагмента белка. Объясните последовательность ваших действий.

Объяснение: нам дана последовательность тРНК, значит задачу мы будем решать с конца: сначала напишем комплементарную цепь иРНК, затем комплементарную двойную цепь ДНК.

тРНК: АГЦ ГЦЦ УЦА ЦГА АГА

иРНК: УЦГ ЦГГ АГУ ГЦУ УЦУ

ДНК1: АГЦ ГЦЦ ТЦА ЦГА АГА

ДНК2: ТЦГ ЦГГ АГТ ГЦТ ТЦТ

Задание №50.

При скрещивании пестрой хохлатой (В) курицы с таким же петухом было получено восемь цыплят: четыре цыпленка пестрых хохлатых, два - белых (а) хохлатых и два - черных хохлатых. Составьте схему решения задачи. Определите генотипы родителей и потомства, объясните характер наследования признаков и появление особей с пестрой окраской. Какие законы наследственности проявляются в данном случае?

Объяснение: такое расщепление возможно только если родители гетерозиготны по окраске, то есть пестрая окраска имеет генотип - Аа

АА - черная окраска

аа - белая окраска

Аа - пестрая окраска

P: АаВВ х АаВВ

G: АВ, аВ

F1: АаВВ - пестрый хохлатый (4 цыпленка)

ааВВ - белый хохлатый (два цыпленка)

ААВВ - черный хохлатый

По окраске расщепление по генотипу и фенотипу одинаковое: 1:2:1, так как здесь присутствует явление неполного доминирования (между и черной и белой окраской появляется промежуточный вариант), признаки наследуются независимо.

Дифференциальное центрифугирование
Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса .
В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при задан
ие
ной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5-10 мин при 3000- 5000 g приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000-50 000 g в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 g в течение 1 ч.
Зональное центрифугирование
Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем); большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 g в течение 1-4 ч.
Равновесное центрифугирование в градиенте плотности
При этом виде центрифугирования частицы разделяются по плавучей плотности, а не по скорости седиментации. Метод широко применяется для разделения различных фракций мембран, так как фрагменты мембран, относящиеся к одному и тому же типу, могут сильно различаться по размеру (и, следовательно, скорости седиментации), но должны иметь одинаковую плавучую плотность. Исследуемые компоненты движутся при цент-рифугировании в градиенте плотности растворенного вещества (для мембран и органелл с плотностью ниже
г/мл обычно используются сахарозные градиенты, а для более плотных структур, таких, как вирусы, применяют соли винной кислоты и хлористый цезий) до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное положение, при котором плотность каждой частицы равна плотности окружающего раствора. Поскольку растворы сахарозы относительно вязкие, градиенты, как правило, фор-мируют заранее. У растворов хлористого цезия вязкость низкая, так что трудно заранее приготовить его градиентный раствор; в этом случае применяют технику изопикнического центрифугирования в градиенте плотности. Пробу смешивают с хлористым цезием в количестве, достаточном для создания плотности, равной средней плотности субклеточных частиц. Эту гомогенную смесь помещают в сосуд для центрифугирования, и в результате седиментации хлористого цезия в поле центробежных сил при центрифугировании формируется его градиент.
Поскольку скорость седиментации частицы постепенно снижается по мере достижения ею той области градиента, где она имеет плотность одинаковую с плотностью раствора, для достижения равновесия центрифугировать требуется очень долго. Это особенно важно для маленьких мембранных везикул, таких, как хроматофори, или для фрагментов цитоплазматических мем-бран клеток, разрушенных на прессе Френча, так как скорость седиментации этих частиц низка даже в отсутствие градиента. Если применять центробежные ускорения порядка 100 000-200 000 g, для более или менее хорошего разделения требуется не меньше 24 ч, а для полного - 72 ч.
Градиенты сахарозы
Концентрация сахарозы в растворах для приготовления градиентов указывается в литературе по-разному: в единицах плотности, в молях сахарозы, в весовых процентах сахарозы (вес/вес), в процентах на единицу объема (вес/объем или г/100 мл). В стандартных химических справочниках есть таблицы для перевода концентраций водных растворов сахарозы из одних единиц в другие. Чаще всего используются весовые проценты са-харозы. При приготовлении сахарозных растворов плотность воды или разбавленных буферов принимают равной 1 г/мл. Следовательно, чтобы приготовить, например, раствор 54%-ной (вес/вес) сахарозы, нужно растворить 54 г сахарозы в 46 мл воды. При этом образуется 100 г раствора, а поскольку плотность 54%-ного (вес/вес) раствора сахарозы равна 1,2451, конечный объем будет 80,3 мл. Приготовление растворов таким путем устраняет необходимость доведения вязких растворов до фиксированных величин объема.
Для создания градиентов промышленностью выпускаются разнообразные устройства, но их применение не обязательно, так как удовлетворительные по качеству градиенты можно приготовить, наслоив друг на друга в центрифужном стакане ряд сахарозных растворов и выдержав в течение ночи, чтобы за счет диффузии образовался непрерывный градиент. Нет необходимости выдерживать градиенты, которые будут центрифугироваться 24 ч и больше, так как за время центрифугирования благодаря диффузии сформируется непрерывный градиент. Мы обычно готовим градиенты из пяти-семи слоев. Когда используются смачиваемые центрифужные стаканы, например, из нитроцеллюлозы или поликарбоната, слои можно наносить, давая им стекать вниз по стенке стакана из пипетки, которую держат под углом к стенке. Если берут несмачиваемые стаканы, такие, как полиалломерные или полипропиленовые, то кончик пипетки при добавлении раствора должен находиться в контакте с мениском, чтобы не происходило перемешивания.
Самый простой метод отбора фракций из сахарозных градиентов заключается в их выкачивании с по-мощью перистальтического насоса. Центрифужный стакан зажимают в круглых лапках (мы применяем кусок прозрачного плекса с просверленным по диаметру стакана отверстием, который зажимаем в лапках), а над ним в круглых лапках закрепляют трубочку небольшого диаметра из нержавеющей стали. Трубочку подсоединяют к насосу и опускают в стакан до соприкосновения с дном. Затем градиентный столбик с помощью насоса раскапывают по находящимся в коллекторе фракций мерным пробиркам.
Детергенты
Детергенты применяются при фракционировании клеток в трех случаях. Когда хотят получить немембранные органеллы, такие, как рибосомы, нуклеоиды и т. д., детергенты обеспечивают мягкое лизирование клеток после нарушения целостности муреина (грамположи- тельные бактерии) или наружной мембраны (грамотри- цательные бактерии). Детергенты применяют также для того, чтобы избирательно перевести в раствор цитоплазматическую мембрану грамотрицательных бактерий, сохранив интактной наружную мембрану, или удалить мембранные загрязнения с рибосом, полисом и стенок грамположительных клеток.
Детергенты представляют собой амфипатические молекулы, т. е. молекулы, имеющие как гидрофильную, так и гидрофобную области; они умеренно растворяются в воде. В очень низких концентрациях детергенты образуют в воде истинный раствор. По мере возраста-ния концентрации молекулы детергента агрегируют с образованием мицелл, в каждой из которых гидрофильные области обращены к воде, а гидрофобные скрыты от воды внутри мицеллы. Концентрацию, при которой по мере добавления детергента к воде начинают образовываться мицеллы, называют критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Каждый детергент характеризуется своими ККМ, размерами и формой ми-целл. Превосходный обзор Хелениуса и Симонса суммирует свойства многих детергентов, применяемых для получения клеточных фракций.
Детергенты можно подразделить на три класса, различающиеся по свойствам мицелл, способности связываться с белками и способности взаимодействовать с другими растворенными веществами. К этим классам относятся ионные детергенты, неионные детергенты и соли желчных кислот. С каждым детергентом связаны свои трудности и свои преимущества при фракционировании клеток.
Ионные детергенты
К самым распространенным ионным детергентам относятся додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия, ДСН), N-лаурилсаркозинат натрия (саркозил), алкил- бензосульфонаты (обычные, применяемые в домашнем хозяйстве детергенты) и соли четвертичных аминов, такие, как бромид цетилтриметиламмония (цетавлон). Ионные детергенты склонны образовывать небольшие мицеллы (с мол. массой - 10 ООО) и имеют относительно высокую ккм (для ДСН ККМ при комнатной температуре в разведенных буферах составляет примерно 0,2%). На ККМ и растворимость ионных детергентов сильно влияют ионная сила раствора и природа присутствующих в нем противоионов. К примеру, 10%-ный раствор ДСН теряет стабильность при температуре около 17 °С, в то время как сходный раствор додецилсуль- фата в трисе стабилен при 0°С. Додецилсульфат калия растворим только при повышенных температурах, и поэтому при использовании этого детергента К+ следует исключать из всех буферов.
Такие детергенты, как ДСН, которые имеют сильно ионизированную гидрофильную группу, не подвержены влиянию изменения реакции среды в широком диапазоне pH и не осаждаются 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Ионные детергенты сильно связываются с белками, и в случае ДСН обычно происходит разворачивание и необратимая денатурация белковых молекул. Хотя ионные детергенты можно удалить диализом, как правило, этого не делают из-за значительного связывания их с белками.
Неионные детергенты
К неионным детергентам относятся тритон Х-100, нонидет Р-40 (NP-40), твин 80 и октилглюкозид. Обычно мицеллы этих детергентов обладают большой моле-кулярной массой (50 000 и больше) и низкой ККМ (0,1% и ниже), что ограничивает их применимость при гель-фильтрации или гель-электрофорезе. На свойства этих детергентов в растворе почти не влияют реакция среды и ионная сила, хотя они могут осаждаться 5%-ной трихлоруксусной кислотой. Неионные детергенты связываются только с гидрофобными белками и, как правило, не вызывают денатурации или потери биологической активности.
Соли желчных кислот
Соли желчных кислот представляют собой соли сте- риновых производных, например холат, дезоксихолат или таурохолат натрия. Из-за того что массивные стери- новые ядра плохо упаковываются, эти детергенты образуют небольшие мицеллы (часто всего из нескольких молекул), а молекулярная масса последних в отличие от других детергентов является функцией концентрации детергента. Поскольку эти детергенты - соли очень плохо растворимых кислот со значениями рКа в области 6,5-7,5, их следует использовать в щелочных диапазонах значений pH. Чтобы избежать трудностей с растворением, применяют концентрированные исходные растворы, которые готовят, растворяя в избытке NaOH соответствующую свободную кислоту. При работе с этими детергентами ионный состав, значение pH и общая концентрация детергента должны поддерживаться на по-стоянном уровне.
Проблемы,
возникающие при использовании детергентов
Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент: белок или детер-гент: липид значительно важнее истинной концентрации детергента. Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2-4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2%-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5-10 мг/мл.
Тритон Х-100, один из самых ценных неионных детергентов, создает трудности при измерениях количества белка, поскольку он содержит ароматический остаток, препятствующий измерению поглощения при 280 нм, а в пробах с участием химических реагентов образует мутный осадок. Мы обычно преодолеваем эту трудность с помощью мечения культуры небольшим количеством 3Н-лейцина. Если метка вводится в минимальную или синтетическую солевую среду, следует позаботиться о том, чтобы добавить туда достаточное количество немеченого лейцина, обеспечив тем самым постоянное в течение всего периода роста включение изотопа из расчета на 1 мг белка. Для Е. coliдостаточно добавить в качестве носителя 20-40 мкг немеченого лейцина, чтобы достичь равномерного включения метки. Когда ввести метку по каким-либо соображениям невозможно, содержание белка измеряют и в присутствии тритона Х-100 модифицированным методом Лоури, описанным в работе [П]. в соответствии с которым к пробе добавляют избыток ДСН. Последний образует стабильные смешанные мицеллы с тритоном, не мешающие измерениям.
Тритон Х-100 и другие сходные с ним неионные детергенты растворяются в водно-спиртовых смесях, а белки из таких смесей можно выделить осаждением в этаноле. Пробу помещают на лед и к ней добавляют при перемешивании 2 объема охлажденного на льду абсолютного этанола. Смесь выдерживают в течение ночи в морозильнике и собирают осадок белка центрифугированием. Для эффективного осаждения требуется концентрация белка не меньше 0,2 мг/мл. Разбавленные растворы белка концентрируют в аппарате для ультрафильтрации фирмы Amicon с помощью фильтра РМ-30. Правда, следует иметь в виду, что при этом концентрируются также и мицеллы детергента.
ДСН удаляют из проб ацетоновым осаждением. Шесть объемов безводного ацетона добавляют к пробе при комнатной температуре, а выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок промывают несколько раз водно-ацетоновой смесью (б -1). Так как осадок часто оказывается воскообразным и с ним трудно работать, мы обычно диспергируем его в воде гомогенизатором Поттера, а затем лиофилизуем.
Электрофорез в полиакриламидном геле
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН представляет собой самый простой и самый эффективный способ выявления набора полипептидов, присутствующих в субклеточных фракциях. Этот метод сейчас во многих случаях заменяет ферментативный и химический анализ при установлении чистоты и гомогенности субклеточных фракций.
Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день.
Для гель-электрофореза в присутствии ДСН имеется большой набор буферных систем. Лучшее разрешение дают концентрированные буферные системы, у которых верхний (электродный) буфер содержит ионы, обладающие большой подвижностью и движущиеся через гель в виде передней зоны, или фронта. К моменту вхождения в разделяющий гель белки сжимаются этим движущимся фронтом в узкую полосу, а войдя в него, задер-живаются за счет того, что гель обладает свойствами «сита». Описанная ниже система представляет собой модификацию концентрирующей буферной системы, предложенной Лэмли . См. также разд. 26.5.1.
Разделяющий, или разгоняющий, гель содержит 11,5% акриламида, 0,2% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,375 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1 % ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель по- лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено- лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН.
Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5 % глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурация всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1-5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (3X0,75 мм) достаточно вносить 5-25 мкг белка. Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток.
Пока исследуемая смесь не вошла в разделяющий гель, устанавливается начальное напряжение, равное 50 В; затем напряжение повышают до 145 В на весь остаток пути. Для наилучшего разрешения температура геля должна быть 25 °С.
Самый распространенный недостаток электрофореза в полиакриламиде состоит в искривлении полос вследствие неправильно проведенной полимеризации. Чтобы этого не было, гелевые растворы нужно тщательно дегазировать перед заливкой, а верхнюю кромку разделяющего геля после полимеризации несколько раз промы-вать, чтобы удалить все остатки незаполимеризовавше- гося геля. Реактивы для электрофореза бывают разными по чистоте, и для того, чтобы время полимеризации было всегда постоянным, необходимо увеличивать или уменьшать количество персульфата аммойия. Для разделяющего геля оптимальное время полимеризации составляет ~30 мин. При большей длительности гель становится мягким или не полностью полимеризуется, а при меньшей - полимеризация может пройти неравномерно, что приведет к появлению волнистых белковых полос. Персульфат аммония очень гигроскопичен и не отличается стабильностью. Рекомендуется готовить исходный концентрированный раствор персульфата аммония (50 мг/мл), который хранят в замороженном состоянии порциями по 1 мл. Такой раствор стабилен в морозильной камере в течение нескольких месяцев.
Полосы могут быть также размазанными из-за присутствующих в пробе липидов и гликолипидов (распространенный случай - присутствие липополисахаридов). Липиды связывают значительную часть ДСН, и фактически их присутствие может привести к истощению ДСН, доступного для связывания с белками, мигрирующими в геле. Эту трудность преодолевают, увеличивая количество ДСН в верхнем электродном буфере до 1 % и выше.
Гели окрашивают по методу Фейербенкса и др. . При слабом покачивании гели вымачивают по 1 ч в каждом из следующих растворов: 1) 525 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 1,0 г кумасси ярко-синего и 1275 мл воды; 2) 210 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,1 г кумасси ярко-синего и 1590 мл воды; 3) 200 мл ледяной уксусной кислоты, 0,05 г кумасси ярко-синего и 1800 мл воды и 4) 10%-ная уксусная кислота. После полного обесцвечивания геля его вымачивают перед высушиванием в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 1 % глицерина.

Дифференциальное центрифугирование

В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при заданной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5--10 мин при 3000-- 5000 д приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000--50 000 § в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 § в течение 1 ч.

Зональное центрифугирование

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем).

Метод дифференциального центрифугированияМетод дифференциального
центрифугирования используется для
фракционирования клеток, т. е. расслоения их
содержимого на фракции в зависимости от удельного
веса различных органоидов и клеточных включений.
В результате центрифугирования компоненты
клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь
в соответствии со своей плотностью. Более плотные
структуры осаждаются при более низких скоростях
центрифугирования, а менее плотные – при высоких
скоростях.

1. Метод, с помощью которого органеллы выделяют из клеток, называют
фракционированием. Этот метод оказался очень плодотворным, дав
биохимикам возможность выделять разные органеллы клетки в
относительно чистом виде. Он позволяет, кроме того, определять
химический состав органелл и содержащиеся в них ферменты и на
основании получаемых данных делать выводы об их функциях в
клетке. В качестве первого шага клетки разрушают путем
гомогенизации в какой-нибудь подходящей среде, которая
обеспечивает сохранность органелл и предотвращает их агрегацию.
2. На следующем этапе клеточный гомогенат подвергают ряду
центрифугирований, скорость и продолжительность которых всякий раз
возрастает; этот процесс называется дифференциальным
центрифугированием. Разные органеллы клетки осаждаются на дне
центрифужных пробирок при различных скоростях центрифугирования,
что зависит от размеров, плотности и формы органелл.

Этапы дифференциального центрифугирования:

3. Образующийся осадок можно отобрать и
исследовать. Быстрее всех осаждаются такие
крупные и плотные структуры, как ядра, а для
осаждения более мелких и менее плотных
структур, таких, как пузырьки
эндоплазматического ретикулума, требуются
более высокие скорости и более длительное
время. Поэтому при низких скоростях
центрифугирования ядра осаждаются, а
другие клеточные органеллы остаются в
суспензии.

Этапы дифференциального центрифугирования:

4. При центрифугировании раньше всего и при
небольших (1-3 тыс. g)ускорениях осядут ядра и
неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут
крупные частицы, макросомы, состоящие из
митохондрий, мелких пластид, пероксисом, лизосом
и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты
вакуолярной системы клетки.
Осадки можно исследовать с помощью
электронного микроскопа, чтобы определить чистоту
полученных фракций. Все фракции до некоторой
степени загрязнены другими органеллами. Если тем
не менее удается добиться достаточной чистоты
фракций, то их подвергают затем биохимическому
анализу, чтобы определить химический состав и
ферментативную активность выделенных органелл.

Центрифугирование в градиенте плотности

Сравнительно недавно был создан другой метод
фракционирования клеток – центрифугирование
в градиенте плотности; при этом
центрифугирование производят в пробирке, в
которой предварительно наслаивают друг на друга
растворы сахарозы все возрастающей концентрации,
а следовательно, и возрастающей плотности. При
центрифугировании содержащиеся в гомогенате
органеллы располагаются в центрифужной пробирке
на тех уровнях, на которых находятся растворы
сахарозы, соответствующие им по плотности.

Похожие статьи